Ricerca Europea

InGenious Hypercare Program: uno studio europeo per la determinazione dei fattori genetico- molecolari coinvolti nella predisposizione allo sviluppo di danno d’organo nel paziente iperteso.
Il nostro gruppo di ricerca è coinvolto in una collaborazione europea nell’ambito dei progetti finanziati dalla CEE. Essa coinvolge numerosi centri europei ed è coordinata dall’Università di Milano.
Lo scopo di questa ricerca è quello di identificare fattori genetico-molecolari direttamente responsabili di una maggiore predisposizione al danno d’organo cardiaco, vascolare e cerebrale nell’ipertensione arteriosa. Lo studio viene condotto attraverso l’arruolamento di soggetti ipertesi di giovane età (prima dei 50 anni) e dei loro stretti familiari (sia ipertesi che normotesi). Tutti i soggetti vengono caratterizzati clinicamente e con esami strumentali (elettrocardiogramma, ecocardiogramma, ecocolordoppler dei tronchi sopra-aortici). Dopo adeguato consenso informato, essi vengono sottoposti a prelievo di sangue per l’esecuzione di analisi genetiche attraverso Genome Wide Analysis e a prelievo di urine per esame proteomico. I parametri clinico strumentali verranno correlati, attraverso adeguata analisi statistica, ai risultati delle analisi genetiche e proteomiche eseguite su sangue e urine.
La ricerca è ancora in corso di svolgimento.
Ricerca Corrente

Ruolo della genetica nel determinismo di accidente cerebrovascolare: utilizzo di un modello animale per identificare fattori genetici coinvolti nella suscettibilita’ allo stroke.

Lo stroke o accidente cerebrovascolare ha un’etiopatogenesi multifattoriale e rappresenta il risultato di una complessa interazione tra numerosi fattori ambientali e numerosi fattori genetici. Tra i classici fattori di rischio per lo stroke, l’ipertensione arteriosa gioca certamente un ruolo determinante. Tuttavia, nel corso dell’ultimo decennio e’ stato riconosciuto anche il ruolo di alcuni determinanti genetici che contribuiscono direttamente alla predisposizione individuale allo stroke. L’identificazione dei fattori genetici coinvolti nella predisposizione allo stroke e la comprensione dei meccanismi di malattia innescati da tali fattori potrebbe consentire di sviluppare nuove strategie preventive e terapeutiche mirate a ridurre i rischi ed i costi di questa comune patologia.
Il nostro gruppo ha sviluppato un progetto di ricerca volto alla identificazione delle basi genetiche dello stroke attraverso lo studio di un modello animale, il ratto spontaneamente iperteso e prono allo stroke (SHRsp). Nel ratto SHRsp, che condivide con l’uomo la suscettibilità all’ipertensione arteriosa e ad una dieta ricca di sodio e povera di potassio, abbiamo dimostrato in precedenza l’esistenza di un’area del cromosoma 1 che contiene un gene con effetto contributorio pari al 20% nella predisposizione allo stroke. Allo scopo di isolare il gene responsabile di stroke all’interno del cromosoma 1, abbiamo successivamente sviluppato delle nuove linee animali ( linee congeniche). Esse contengono l’area cromosomica di linkage del cromosoma 1, per esteso oppure in parte, in una configurazione genetica prona allo stroke o resistente allo stroke all’interno del background genetico opposto. La successiva caratterizzazione fenotipica ha mostrato che le linee animali contenenti l’area di linkage in forma “stroke-resistente” all’interno del background “stroke-prone” possiedono una maggiore resistenza allo stroke. Per converso, le linee congeniche reciproche hanno mostrato un’incidenza di stroke del 20% dopo tre mesi di trattamento dietetico, contro lo 0% osservato nel ceppo parentale “stroke-resistente” a tutti i tempi di dieta. Pertanto, questa analisi supporta ulteriormente il ruolo contributorio allo stroke della componente genetica contenuta all’interno dell’area del cromosoma 1.
Grazie alla recente decodificazione del genoma di ratto disponiamo attualmente di una mappa genica molto piu’ precisa dell’area cromosomica di interesse ed, in particolare, sappiamo che entro i 10 cM dal picco di LodScore dell’area di linkage del cromosoma 1 mappano alcune sequenze geniche che codificano per proteine coinvolte in importanti funzioni cellulari che potrebbero essere correlate, quando compromesse, ad un meccanismo di danno vascolare ed al conseguente evento clinico.
In particolare, il nostro interesse si e’ recentemente focalizzato sullo studio di sequenze geniche che codificano per proteine coinvolte nei processi di respirazione cellulare a livello mitocondriale e nella produzione di stress ossidativo (un elemento fondamentale nella determinazione di sofferenza e danno cellulare soprattutto a livello vascolare). Infatti, i nostri studi stanno rivelando importanti informazioni sulla relazione tra alterata funzione mitocondriale, il conseguente aumento dello stress ossidativo e il danno cerebrovascolare nel modello animale.
Le informazioni ottenute dallo studio del modello animale vengono poi estese alla malattia umana attraverso la caratterizzazione del ruolo dei fattori genetici identificati nell’animale in popolazioni umane selezionate per stroke (sia stroke dell’adulto che stroke giovanile).
Abbiamo pertanto già pubblicato una serie di studi genetici condotti sulle popolazioni umane affette da stroke con risultati sia negativi che positivi.

Ruolo dei peptidi natriuretici, con particolare riguardo al peptide natriuretico atriale, nella patogenesi delle malattie cardiovascolari: impatto dei livelli circolanti e delle alterazioni strutturali di questa classe di peptidi sulla prevenzione, diagnosi e prognosi  delle principali malattie cardiovascolari.

La famiglia dei peptidi natriuretici include principalmente il fattore natriuretico atriale (ANP), quello cerebrale (BNP) ed il CNP (prodotto dall’endotelio vascolare).
Il fattore natriuretico atriale svolge un ruolo importante nel controllo dell’equilibrio idroelettrolitico e dell’omeostasi pressoria attraverso le sue note funzioni di vasodilatazione, promozione della diuresi e della natriuresi. Inoltre, esso e’ significativamente coinvolto nei processi di rimodellamento cardiovascolare. Recenti evidenze sperimentali, fisiopatologiche ed epidemiologiche hanno evidenziato un ruolo significativo dell’ANP nella predizione di rischio cardiovascolare in soggetti apparentemente sani (popolazione nordamericana di Framingham), nella determinazione di eventi cerebrovascolari e di infarto del miocardio, nella modulazione di ipertrofia ventricolare sinistra, nella maggiore suscettibilità allo sviluppo di ipertensione arteriosa nell’uomo. Modelli animali geneticamente manipolati di knock out e di iperespressione del gene ANP supportano le evidenze ottenute nell’uomo.
Le evidenze epidemiologiche e sperimentali sottolineano innanzittutto un importante ruolo etiopatogenetico dei livelli circolanti dell’ANP. Infatti, elevate concentrazioni associano con un aumentato rischio di malattie cardiovascolari quali lo stroke e l’infarto del miocardio, mentre basse concentrazioni aumentano il rischio di ipertensione arteriosa e di ipertrofia ventricolare sinistra. Nei nostri studi abbiamo precedentemente dimostrato che una variante del promotore del gene ANP, associata ad una riduzione dei livelli circolanti del peptide, era significativamente associata ad ipertrofia ventricolare sinistra in soggetti con ipertensione arteriosa essenziale. Abbiamo inoltre evidenziato un significativo ruolo dei livelli di ANP sia nella predizione che nella prognosi delle malattie cardiovascolari. Livelli elevati di ANP sono associati ad un maggior rischio cardiovascolare nella popolazione generale stimato per i prossimi dieci anni di vita.
Accanto al ruolo dei livelli circolanti dell’ANP, i nostri studi hanno sottolineato anche quello delle alterazioni strutturali del peptide responsabili, a loro volta, di alterazioni funzionali dello stesso.
In particolare, abbiamo ottenuto evidenza che mutazioni strutturali del gene codificante l’ANP sono significativamente associate ad un maggior rischio di sviluppare eventi cerebrovascolari sia nel modello animale per stroke che nell’uomo e ad un maggior rischio di infarto del miocardio nell’uomo. In relazione al gene umano, abbiamo caratterizzato due mutazioni codificanti: una localizzata all’interno dell’esone 1, corrispondente ad una sostituzione aminoacidica Val/Met nel prosegmento del peptide finale; ed una seconda corrispondente ad una mutazione dello stop codon all’interno dell’esone 3 e responsabile di un allungamento di due aminoacidi del peptide finale.
Studi in vitro in cellule endoteliali ci hanno consentito di dimostrare un effetto pro-ossidante della mutazione dell’esone 3 con azione antiproliferativa ed antiangiogenetica. Allo stesso modo, il blocco della formazione di radicali liberi dell’ossigeno ha ripristinato le normali capacità proliferative ed angiogenetiche delle cellule endoteliali. Studi in corso stanno caratterizzando la via recettoriale ed i meccanismi di signaling intracellulare impiegati da questa variante molecolare dell’ANP per produrre i suoi effetti deleteri sulle cellule della parete vascolare.
Sulla base dei nostri studi è possibile proporre uno screening basato sia sulla misurazione dei livelli circolanti che sulla determinazione dello stato di portatore della variante molecolare dell’ANP in tutti i pazienti affetti da malattie cardiovascolari. Tale screening potrà fornire importanti informazioni diagnostiche e prognostiche nei pazienti in oggetto.

 Altri progetti

Basi genetico-molecolari delle alterazioni vascolari funzionali e strutturali in un modello animale di stroke.
Abstract del progetto PRIN finanziato dal Ministero dell’Istruzione, Universita’ e Ricerca
(Anni 2011-2013)

Nell’ambito delle patologie che colpiscono le societa’ piu’ industrializzate, lo stroke rappresenta una malattia molto comune ed, in particolare, costituisce la terza causa di mortalita’ e la prima causa di invalidita’. Si rende pertanto necessaria una piu’ completa conoscenza dei meccanismi responsabili di questa malattia allo scopo di consentire lo sviluppo di nuovi approcci diagnostici, prognostici e terapeutici capaci di limitare i rischi ed i notevoli costi sanitari imposti da questa comune patologia.
Nel corso degli ultimi anni sono state ottenute molte evidenze dell’esistenza di componenti genetiche che contribuiscono, sia direttamente che attraverso l’interazione con gli altri fattori di  rischio, alla suscettibilita’ individuale allo stroke. Tuttavia, le basi genetiche dello stroke nell’uomo appaiono complesse e difficili da investigare in quanto questa condizione patologica ha una base poligenica. Pertanto, un interessante approccio per la ricerca delle basi genetiche dello stroke e’ fornito dall’utilizzo di modelli animali specifici che presentano rilevanti omologie con la malattia umana. Nel caso dello stroke, il modello e’ rappresentato da un ceppo di ratto spontaneamente iperteso (SHR) con una spiccata tendenza agli eventi cerebrovascolari, il ratto SHRsp, rispetto al suo controllo SHRsr (stroke resistente). L’evento cerebrovascolare e’ favorito dagli elevati valori pressori e da una dieta ricca di sodio e povera di potassio (dieta stile giapponese). In questo modello animale sono state precedentemente individuate aree cromosomiche contenenti geni direttamente responsabili di stroke. In particolare, uno di essi, il gene codificante il fattore natriuretico atriale, contenuto all’interno di un’area di linkage nel cromosoma 5 del ratto, e’ stato poi fortemente correlato all’incidenza di eventi cerebrovascolari anche nell’uomo (indicando pertanto la notevole ricaduta clinica delle acquisizioni fatte nel modello SHRsp). Una seconda area di linkage e’ stata localizzata all’interno del cromosoma 1 del ratto ed e’ stata successivamente isolata e trasferita all’interno di nuove linee animali, le linee congeniche. La caratterizzazione fenotipica di queste nuove linee animali ha pertanto consentito di osservare che la presenza di uno specifico segmento di quest’area in forma prona allo stroke induce predisposizione allo stroke in linee resistenti e viceversa. La recente decodificazione del genoma di ratto consente di conoscere in maniera piu’ accurata la mappa dei geni che cadono all’interno dell’area, e, tra questi, alcuni rappresentano ottimi geni candidati sia per la loro localizzazione in corrispondenza del picco di Lod Score, sia per le proprieta’ funzionali delle proteine da essi codificate.
Gli obiettivi, che verranno perseguiti attraverso un approccio multidisciplinare e con l’integrazione operativa dei gruppi coinvolti, si possono sintetizzare nei seguenti punti principali: 1) applicare una procedura di sequenziamento diretto dei geni candidati che mappano nelle immediate vicinanze del picco di Lod Score dell’area cromosomica di linkage del cromosoma 1 di ratto, allo scopo di rilevare le differenze strutturali esistenti tra le linee animali con predisposizione allo stroke e quelle resistenti. Tale approccio sara’ seguito dalla caratterizzazione in-vitro della rilevanza funzionale delle mutazioni identificate e da un’analisi dei livelli di espressione genica e proteica delle stesse sequenze nel tessuto cerebrale e renale di ratti proni e resistenti allo stroke, esposti ad una dieta normale o alla dieta favorente l’evento cerebrovascolare; 2) eseguire un’analisi accurata del danno strutturale e funzionale vascolare e del danno renale in relazione all’occorrenza dello stroke nelle linee congeniche, e metterlo in relazione alle alterazioni genetiche riscontrate; 3) trasferire alla malattia umana le acquisizioni fatte sul modello animale, attraverso la caratterizzazione di specifiche popolazioni selezionate per stroke.

Pubblicazioni più rilevanti degli ultimi 3 anni

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